DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS EN DIFERENTES MATRICES

RESUMEN

Los lípidos son un grupo de substancias que, por lo general, son solubles enéter, cloroformo u otros solventes orgánicos pero prácticamente insolubles enagua.

El contenido total de lípidos se determina comúnmente por métodos deextracción con disolventes orgánicos (por ejemplo Soxhlet, Goldfish,Mojonnier), sin embargo también puede cuantificarse por métodos deextracción que no incluyen disolventes (por ejemplo, Gerber, Babcock) y por métodos instrumentales que se basan en propiedades físicas o químicas de loslípidos (por ejemplo, infrarrojo, densidad y absorción de rayos x).

Importancia de la determinación de las grasas:

Para propósitos de información de etiquetas nutricionales.

Para determinar si el alimento reúne los requisitos de estándar deidentidad y es uniforme.

Para entender los efectos de las grasas y aceites en las propiedadesfuncionales y nutricionales de los alimentos.

Determinación de grasas en los alimentos

Métodos de extracción con solventes

Métodos de extracción húmeda sin solventes

Métodos instrumentales

Métodos de extracción con solventes:

La preparación de la muestra depende del tipo de alimento y el tipo ynaturaleza de los lípidos que contiene.

Criterios para la selección de solventes

Deben evaporarse rápido y no dejar residuo.

Deben tener un bajo punto de ebullición.

No deben ser inflamables

No deben ser tóxicos en estados líquidos y de vapor.

Deben penetrar a las partículas de la muestra inmediatamente.

ABSTRAC

Lipids are a group of substances, usually soluble in Ether, chloroform or other organic solvents but virtually insoluble petticoat.

The total lipid content is commonly determined by deextracción methods with organic solvents (for example Soxhlet Goldfish, Mojonnier), however can also be quantified by methods deextracción not include solvents (e.g., Gerber, Babcock) and by instrumental methods based on physical or chemical properties of loslípidos (eg, infrared, density and x-ray absorption).

Importance of determination of fat:

Para purposes of nutritional information labels.

Para determine whether food meets the requirements of standard deidentidad and uniform.

Para understand the effects of fats and oils in propiedadesfuncionales and nutritional food.

Determination of fat in food

Métodos solvent extraction

Métodos wet solventless extraction

Métodos instrumental

Solvent extraction methods:

The sample preparation depends on the type of food and the type ynaturaleza of lipids.

Criteria for the selection of solvents

Deben evaporate quickly and leave no residue.

Deben have a low boiling point.

No be flammable

No be toxic in liquid and vapor states.

Deben particles penetrate the sample immediately.

PALABRAS CLAVES:

·         HIDROFÓBICOS

·         SOLVENTES

·         HIDROFÍLICA

·         ANFIPÁTICO

·         ALIFÁTICO

·         POLARES Y APOLARES

INTRODUCCIÓN

Grasa, sustancia orgánica insoluble en agua que se encuentra en el tejido adiposo y en otras partes del cuerpo de los animales, así como en los vegetales, especialmente en las semillas de ciertas plantas; está constituida por una mezcla de ácidos grasos y ésteres de glicerina y sirve como reserva de energía.

"los lípidos se clasifican en complejos (tienen ácidos grasos en su molécula) y sencillos"

DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS

 Métodos de extracción directa de los lípidos

§  Método de Soxhlet

El método consiste en una extracción de lípidos semi-continua con el solvente o mezcla de solventes orgánicos adecuado según el tipo de grasa a extraer.

Preparación de la muestra y extracción de los lípidos: En un cartucho de papel de filtro  colocar la muestra seca y pesada (conviene utilizar lo proveniente de la determinación de humedad por el método indirecto), y ponerla en el tubo extractor. Tarar el balón del aparato y conectarlo al mismo. Por la parte superior del tubo extractor agregar el solvente adecuado (éter etílico, éter de petróleo, mezcla de ambos, etc.) hasta que descargue el sifón, agregando además alrededor de la mitad del contenido del tubo extractor. Calentar para que se produzcan al menos 7 ciclos de llenado y sifonado del tubo extractor (durante 2 horas aproximadamente).

Recuperación y eliminación del solvente: Quitar el cartucho del tubo extractor con el resto de la muestra. Volver a armar el equipo y recuperar el solvente limpio que se va acumulando en el tubo extractor.  Una vez que queda un pequeño volumen en el balón separar el solvente de los lípidos por evaporación a baño María o en baño de arena caliente. Colocar el balón con los lípidos unos 10 minutos en estufa y pesar.

Cálculos: una vez conocida la masa de lípidos libre de solvente orgánico, calcular el porcentaje de grasa en la muestra teniendo en cuanta la masa inicial de muestra colocada en el cartucho de extracción.

Nota: Esta determinación suele denominarse extracto etéreo (si se utiliza éter), pues además de los lípidos se extraen otros compuestos solubles en el solvente.

Métodos de extracción de los lípidos previa liberación de la fase grasa

§  Método de Schmid-Bondzynski-Ratzlaff

Es un método muy empleado para determinar los lípidos en queso y en leche en polvo. En vaso de precipitado de 100 ml colocar la cantidad adecuada de muestra, agregar 10 ml de HCl (d =1,19) y calentar a BM hasta que las proteínas se hayan disuelto. Dejar enfriar, transferir el contenido a una probeta graduada con tapa esmerilada, lavando el vaso de precipitado con unos 10 ml de alcohol etílico en dos porciones y luego agregar 50-60 ml de éter. Dejar en reposo 24 horas y leer el volumen de la fase etérea. Tomar una alícuota exactamente medida y evaporar el éter en un vaso de precipitado pequeño previamente tarado. Una vez evaporado el éter pesar nuevamente y determinar el contenido de lípidos por diferencia, teniendo en cuenta la alícuota tomada para realizar los cálculos.

§  Método de Gerber

Materia grasa en leche fluida

Se utilizará un butirómetro para leche y ácido sulfúrico Gerber. El H₂SO₄ Gerber d = 1,82 g/ml, se prepara con 94,2 ml de ácido sulfúrico concentrado (d = 1,84) y 5,8 ml de agua destilada (no agregar NUNCA agua sobre ácido sino ácido sobre agua).

Medir con pipeta 10 ml de H₂SO₄ Gerber e introducirlos en un butirómetro para leche, cuidando no mojar las paredes internas del cuello. Agregar con rapidez 11 ml de leche medidos con pipeta de doble aforo, de manera que forme una capa sobre el ácido sin mezclarse con éste. Agregar inmediatamente 1 ml de alcohol amílico y tapar con el tapón correspondiente. Tomar el butirómetro con un paño seco sujetando el tapón y agitar por inversión suave pero efectiva. Verificar que esté bien tapado y colocarlo en un baño de agua a 65-70 °C durante 5 a 10 minutos con el tapón hacia abajo. Retirar del baño, secarlo y centrifugarlo en la centrífuga especial con los tapones hacia afuera. Llevar nuevamente a baño de agua durante aproximadamente 5 minutos hasta que alcance la temperatura del agua (65-70 °C) y leer de inmediato el volumen de fase grasa separada en la parte superior graduada del butirómetro. El volumen leído corresponde directamente al porcentaje de grasa en la leche.

Materia grasa en crema o manteca

Se utiliza un butirómetro similar al utilizado para leche, pero abierto en sus dos extremos y con una copita de vidrio en el tapón que obtura la base, en la que se pesa la muestra. La graduación del vástago es de 0 a 70.

Se pesan en la copita 4 a 5 g de muestra (algo menos en el caso de la manteca), se la coloca en el butirómetro, se ajusta bien el tapón y por la otra boca se agregan 10 ml de agua destilada, 10 ml de H₂SO₄ Gerber (d = 1,82) y 1 ml de alcohol amílico, se tapa, se toma con un repasador y sujetando el tapón se agita hasta disolución total. Se coloca luego durante 5 min en baño María a 60-70 °C con el bulbo hacia abajo. Conviene atar los tapones, pues sino se corre el riesgo de que salten y se pierda la determinación. Una vez cumplido el tiempo de calentamiento, se centrifuga 5 min en la centrífuga Gerber con el ápice hacia adentro. Volver al baño María 5 min y leer inmediatamente el volumen que ocupa la fase grasa.

Cálculo: Se aplica la fórmula siguiente:

        L x 5

materia grasa = --------- - 0,5 = g%

        p

  L: lectura en el butirómetro

  5: porque el butirómetro está graduado para 5 gr de muestra.

  p: gramos de muestra pesados.

  0,5: factor de corrección.

Método de Rose Gottlieb- Método de referencia.

Aplicaciones:

Leche, leche semidescremada, leche en polvo

Leche condensada azucarada y sin azucarar

Nata y nata batida

Lactosuero

Reactivos:

Solución de NaCl 0,5% p/v

NH₄OH (densidad 0.91)

Etanol 96°

Eter dietílico: intervalo de ebullición 30-60°C

Eter de petróleo: intervalo de ebullición 30-60°C

Determinación:

Se seca un matraz Erlenmeyer con boca esmerilada de 200 ml con algunas perlas de vidrio durante 1h a 103 +/- 2°C, e coloca en desecador y se pesa con una precisión de +/- 1mg.

La muestra se pesa también al mg, de acuerdo a los valores recomendado en la tabla, en el tubo de extracción de Mojonnier, diluyéndose con agua destilada si fuera necesario hasta un volumen de 10 ml (en el caso de la nata debe utilizare la solución de NaCl) y se agita hasta que el producto se haya dispersado totalmente (para la leche en polvo es conveniente calentar el tubo de extracción y su contenido durante 15 minutos en un baño de agua a 60-70°C agitando ocasionalmente). A continuación se añaden 2 ml de amoníaco, se mezcla y tras enfriar se añaden 10ml de etanol. Después de añadir 25 ml de éter dietílico, se tapa el tubo de extracción y se agita durante 1 minuto invirtiéndolo sujetando el tapón. Finalmente se añaden 25 ml de éter de petróleo y se vuelve a agitar durante 30 segundos. Una vez que las fases se han separado completamente, lo que sucede después de dejar reposar el tubo de extracción o centrifugándolo durante 5 minutos a 500-600 r.p.m., se pasa tanta fase orgánica (superior) como sea posible al erlenmeyer previamente pesado. Se repite una segunda vez la extracción del residuo acuoso con otros 15 ml de éter dietílico y éter de petróleo como se detalló más arriba. A continuación se reúnen las fase orgánicas, se destilan los solventes (también el etanol)  y se seca el residuo que queda en el matraz erlenmeyer durante 1h a 103 +/- 2°C. Se enfría en desecador y se pesa con una precisión de +/- 1mg. El secado se repite hasta obtener peso constante.

Pesos recomendados de muestra

Producto lácteo	Peso en gramos
Leche entera en polvo	1-1,1
Leche descremada en polvo	1,5-1,6
Nata, nata batida	2-3
Leche condensada azucarada	3-3,5
Leche condensada sin azucarar	4-5
Leche entera, leche desnatada	10-11

Cálculo

El porcentaje de grasa G se calcula de acuerdo con la siguiente igualdad:

G [%]= [(m₂-m₁) . 100]/M

                                                       

m₁: masa en gramos del matraz  erlenmeyer con las perlas.

m₂: masa en gramos del matraz  erlenmeyer con las perlas con grasa tras el secado

Nota: Es conveniente realizar un ensayo en blanco sustituyendo la muestra por 10 ml de agua destilada.

Materia grasa en dulce de leche. Método de Rose Gottlieb

 Reactivos

NH₄OH conc.

Etanol

Eter etílico

Eter  de petróleo

Pesar un gramo de muestra en papel satinado previamente tarado. Encerrar parcialmente el dulce de leche (debe entrar en contacto con los reactivos) e introducir hasta el fondo en una probeta de 50 ml con tapa. Agregar 5 ml de agua destilada y agitar hasta que se disuelva el dulce de leche (si es necesario calentar a B.M. a 60 °C). Enfriar y agregar 1 ml de NH₄OH conc. Agitar y agregar 5 ml de etanol. Agitar y agregar con pipeta aforada 10 ml de éter etílico. Agitar 30 seg. y agregar con pipeta aforada 10 ml de éter de petróleo. Volver a agitar y leer bien el volumen total de la mezcla. Dejar reposar entre 4 y 24 hs. en lugar fresco (hay que evitar la evaporación de solventes; si esto ocurriera se notará una disminución en el volumen leído). Con pipeta aforada tomar 10 ml de la fase superior etérea y evaporarlos en un pequeño cristalizador tarado. Dejar enfriar en desecador, pesar y expresar en % de grasas.

Métodos de extracción de lípidos totales

Para la obtención de lípidos totales, especialmente a partir de tejidos animales, vegetales o bacterias, las mezclas de cloroformo/metanol (2:1 v/v) (método de Folch) o cloroformo/metanol/agua (2:1:1 v/v/v) (método de Bigh and Dyer) logran una extracción más exhaustiva que los sistemas de solventes simples.

Método de Folch (Folch et al., J Biol Chem 1957, 226, 497)

Pesar la masa deseada de muestra. Agregar 10 volúmenes (ml/g muestra) de metanol y homogeneizar. Agregar 20 volúmenes de cloroformo y agitar. Agregar agua o solución salina (NaCl 0,73 %) (2 % del volumen de los solventes). Centrifugar para separar las fases. Separar la fase orgánica (inferior), filtrándola a través de filtro de papel conteniendo Na₂SO₄ anhidro a fin de eliminar restos de agua. Evaporar el cloroformo y pesar la masa de lípidos obtenida.

 EL METODO QUE EMPLEAMOS FUE EL SOXHLET

YEL MÉTODO DE BLIGH DYER.

METODOLOGIA

Método Soxleth

1.Pesar de 5 a 10 gramos de leche en polvo,

2. aparte pesar un papel filtro y darle la forma de cono.

3. Incorporar la muestra en el cono de papal filtro

4. Colocar el cono con muestra en el tubo de extracción y adicionar el solvente 300 ml (eter de petróleo o benceno) al matraz Previamente tarado.

5. Extraer la muestra con solvente por 2 horas.

6. Cuando se completa la extracción recuperar el solvente por destilación simple.

7. Secar el matraz en estufa a 103 ± 2°C por 30 min, enfriar en desecador y pesar.

8. Sacar el residuo del tubo extracto y desecar en estufa. Pesar el residuo de la muestra del tubo extractor. calculos

M: peso de la muestra en gramos

Método de Bligh Dyer:

 1. Se debe determinar la humedad de la muestra para mantener la relación de cloroformo, metanol y agua, en las diferentes etapas de análisis. Es indispensable ajustar la humedad de la muestra a un 80 +/- 1%, pues las relaciones de volumenes de cloroformo, metanol y agua deben ser de 1:2:0.8 y de2:2:1.8 luego de la dilución.

 2. Se pesan 10 g de pasta homogénea en un vaso precipitado.

 3. Se agregan 10 ml de cloroformo y 20 ml de metanol.

 4. Se extrae utilizando agitador magnético durante10 minutos.

 5. Se agregan 10 ml de cloroformo y se homogeniza durante 5 minutos.

 6. Se agregan 10 ml de agua y se vuelve a homogenizar durante 5 minutos.

 7. Se vierte el líquido en una probeta graduada de 100 ml, para que la extracción sea cuantitativa se enjuaga el vaso precipitado que contenía la muestra con 10 ml de cloroformo y se vierte en la probeta.

 8. Se deja reposar la mezcla cloroformo metanol, hasta observar una completa separación de dos fases.

 9. Se lee el volumen de la capa clorofórmica.,

 10. Se retira la capa metanol agua, por aspiración retirando también un pequeño volumen de la capa clorofórmica para asegurar la completa remoción de la capa superior.

 11. Se pipetean 10 ml de la capa clorofórmica y se llevan a un recipiente previamente tarado.

 12. Se evapora el cloroformo a 40ºC en un baño termostatado.

 13. Se lleva a estufa a 105ºC durante 1 hr.

 14. Se enfría en desecador y se pesa.

 15. Se repite el procedimiento hasta llegar a peso constante. Cálculos:

-% Lípidos en base seca.

- % Lípidos en base Húmeda.

ANALISIS

LO QUE OBTUVIMOS FUE UNA GRASA DE COLORACION AMARILLA ESTA GRASA SE OBTUVO POR DOS METODOS DISTINTOS EN LOS CUALES SE REALIZO UN PROCESO DE CONDENSACION NOS DIMOS CUENTA QUE LA CANTIDAD Y EL TIEMPO DE EXTRACCION DEPENDE DE EL PROCESO ALGUNOS SO MAS RAPIDOS QUE OTROS , LOS LIPIDOS SON SUSTANCIAS PRESENTES EN MUCHS TIPOS DE COMPUESTOS , SE ENCUENTRAN EN LAS PLANTAS  Y ANIMALES SON RESERVAS DE ENERGIAS Y SON INSOLUBLES EN AGUA, APRENDIMOS QUE EL PUNTO DE EBULLICION ES RELATIVAMENTE ALTO LO QUE PERMITE LA CONSERVACION DE ESTA SUSTANCIA EN LA CONDENSACION. 

CONCLUSIONES

El porcentaje de grasas que contiene la harina es significativamente bajo.

La densidad de las soluciones es de vital importancia para la extracción de estas sustancias . 

El método Soxleth no es el más efectivo para la extracción de lípidos puesto que su extracción requiere un periodo de tiempo considerablemente más largo en comparación a otros métodos y este no es muy eficiente en cuanto a la cantidad de grasas obtenidas.

El método Bligh Dyer tiene un montaje más sencillo y el porcentaje de lípidos que extrae es mayor al del método anterior; sin olvidar que esta extracción se realiza en menor tiempo . 

ANEXOS